本论文主要研究人CD154蛋白的原核表达。在GST原核表达最优条件下进行大量表达，并经过GST柱层析纯化，以获得纯度较高的目的蛋白用于免疫学实验。本研究是根据目的蛋白CD154基因序列设计合成特异性引物，PCR扩增基因，并插入到融合蛋白原核表达载体pGEX－4T－1中，得到重组表达质粒pGEX－4T－1/CD154，用此重组质粒转化大肠杆菌DH5-α细胞，转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定。并通过采用不同IPTG诱导浓度及不同的培养温度和时间，使GST融合蛋白在大肠杆菌DH5-α中得到最大表达，并采集样品进行SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。通过对转化后的大肠杆菌进行SDS-PAGE电泳分析，发现明显的出现了54kD蛋白带。且最佳表达条件：37℃，IPTG诱导浓度0.2mM，诱导时间4h。本研究成功构建了GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出GST融合蛋白，经过提纯的GST融合蛋白可以用于更深层次的免疫实验。移植排斥反应发生的主要机制是T细胞介导的免疫答应。CD154是一种分子量为29KD～39KD的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要存在于激活的T细胞，它是CD40分子的配体。研究表明[35]，在免疫应答过程中，T细胞上的CD154分子与抗原呈递细胞上的CD40分子结合，信号通过CD40分子传递，引起抗原呈递细胞上B7分子的表达，B7分子与T细胞上的CD28分子结合，为T细胞的活化提供第二信号。已经有资料证明[36]，CD154抗体可以阻断CD40与CD154分子的结合，使CD40信号传递中断，B7分子不能表达，T细胞缺乏第二活化信号，导致T细胞无反应性。因此，探讨CD154单克隆抗体抗移植排斥反应作用已成为移植免疫研究领域中的一个新的热点。我们构建全长的人CD154 cDNA原核表达质粒，表达人GST-CD154融和蛋白，为制备人CD154单克隆抗体，进而研制成新的免疫抑制剂打下基础。虽然有许多种大肠杆菌宿主菌都可以用来对pGEX载体进行克隆和表达，但是有一些经过特殊改造的菌株更适合表达融和蛋白，而且特别适于表达全长的融和蛋白。菌株中有一些已知的细胞质蛋白酶基因产物，如lon，OmpT，DefP或HtpR；缺失这些基因的宿主菌可以降低由宿主细胞内蛋白酶降解的影响，从而有利于融合蛋白的表达。
通过比较各种大肠杆菌的原核表达性能，最终本研究确定具有最大转化效率及较高融合蛋白表达的大肠杆菌DH5-α作为宿主菌。
2.2.2 重组质粒载体的构建[37]
选用谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-trabsferase，GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1，将载体用核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后,进行琼脂糖电泳割胶回收，再加入经P④加入400 ml Solution III，立即上下颠倒5－10次，使之充分中和，室温放置2min。
⑤15000rpm离心10min。
⑥取出2ml样品收集管和3S柱，将上清液全部转移到3S柱子里。室温放置2min，12000rpm离心2min。
⑦取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，高速离心1min。
⑧取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集

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