
内生真菌HCCB3616的分类鉴定
作品编号:SWHX0161 开发环境: WORD全文:25页 论文字数:9200字 此内生真菌HCCB3616的分类鉴定毕业设计完整版包含[论文] |
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本论文利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源,通过抗菌模型的筛选,获得多株活性功能菌株,对其中一株活性较高的HCCB3616进行了菌种鉴定。主要研究工作包括以下几个方面:
对内生真菌HCCB3616进行分离和培养,观察菌体的形态特征。提取它的染色体DNA,进行PCR扩增,以确定其种属分类地位。
本文采用18S rDNA序列测定与传统形态学观察相结合的方法,对活性菌株HCCB3616进行分类鉴定,各种指标鉴定其为链格孢霉属(Alternaria sp.)。
(1)将已长好的斜面接种于装有25ml PDA液体培养基的250ml三角瓶中,28℃、220rpm培养48h后,离心(10000rpm,10min,4℃),弃去上清,吸干残余液体,使深沉尽可能干燥。
(2)取2g湿菌体于研钵中研磨后,转入10ml的离心管中,加入2ml 65℃预热并已加入1%巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液,轻轻摇动离心管使菌丝体在提取缓冲液中均匀分散,65℃温浴1h并不时转动离心管。
(3)混合物冷却后加入等体积的苯酚/氯仿(v/v,1∶1),混匀,分装并离心(12000rpm,2min)。
(4)取上层清液于另一离心管,若中间蛋白层较厚,重复(3)操作。
(5)加入1/10体积的醋酸钠(3mol/L,pH5.4)和0.6体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀。
(6)用封口毛细管缠起染色体DNA。
(7)用1ml 70%的乙醇洗涤DNA30s。
(8)重悬DNA于1ml TE缓冲液,经适当稀释后,分别于260nm和280nm测DNA样品的A值,样品保存于4℃冰箱中。用光路为1.0cm比色杯测量DNA的浓度时,可根据如下公式计算:
DNA(μg/ml)=A260×50×稀释倍数
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对内生真菌HCCB3616进行分离和培养,观察菌体的形态特征。提取它的染色体DNA,进行PCR扩增,以确定其种属分类地位。
本文采用18S rDNA序列测定与传统形态学观察相结合的方法,对活性菌株HCCB3616进行分类鉴定,各种指标鉴定其为链格孢霉属(Alternaria sp.)。
(1)将已长好的斜面接种于装有25ml PDA液体培养基的250ml三角瓶中,28℃、220rpm培养48h后,离心(10000rpm,10min,4℃),弃去上清,吸干残余液体,使深沉尽可能干燥。
(2)取2g湿菌体于研钵中研磨后,转入10ml的离心管中,加入2ml 65℃预热并已加入1%巯基乙醇的2×CTAB提取缓冲液,轻轻摇动离心管使菌丝体在提取缓冲液中均匀分散,65℃温浴1h并不时转动离心管。
(3)混合物冷却后加入等体积的苯酚/氯仿(v/v,1∶1),混匀,分装并离心(12000rpm,2min)。
(4)取上层清液于另一离心管,若中间蛋白层较厚,重复(3)操作。
(5)加入1/10体积的醋酸钠(3mol/L,pH5.4)和0.6体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀。
(6)用封口毛细管缠起染色体DNA。
(7)用1ml 70%的乙醇洗涤DNA30s。
(8)重悬DNA于1ml TE缓冲液,经适当稀释后,分别于260nm和280nm测DNA样品的A值,样品保存于4℃冰箱中。用光路为1.0cm比色杯测量DNA的浓度时,可根据如下公式计算:
DNA(μg/ml)=A260×50×稀释倍数
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