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油菜转录因子BnWRI1提高种子含油量的研究

作品编号:SWHX0396 开发环境: WORD全文:24页 论文字数:10000
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①将Col-0的种子悬浮于0.01%的琼脂溶液中,4℃处理2d以使发芽整齐。
②按体积比6∶2∶1将蛭石、草炭和珍珠岩混合好,装入盘中,播种密度为100~120 株/ 盘。
③当拟南芥的主枝开始现蕾时(约40d生长期),打顶,以促进侧枝生长。农杆菌转化前1d去掉已结实的荚果。培养室保持温度在22~24℃,相对湿度为80%,光源为荧光灯,光照强度为85 µmol s-1m-2,光照时间为16h/d。
④农杆菌菌株为EHA105 (含质粒),挑单菌落于YEP液体培养基中,28℃下振荡培养2d,加抗生素利福平、卡那霉素至终浓度至分别为25mg/L 和50mg/L。按1∶50的比例在新鲜的含抗生素的YEP液体培养基中扩大培养至指数生长中期(菌液OD6 0 0≈1.5)。3000rmp离心10min,弃上清。将沉淀重新悬浮于渗透培养基,组成为含5%蔗糖和0.05% SilwetL-77(表面活性剂)的1/2 MS液体培养基,调OD600≈2.0。
⑤用花序浸泡技术(Flora dip)进行转化,即将拟南芥的花序全部在转化液中浸泡1-2min,并轻轻摇晃。保鲜膜覆盖1~2d,保持相对湿度大于95%,以利农杆菌侵染转化。隔4-5d后按上述方法重复转化,共转化3-4次。待种子成熟后(约20d)收获干燥。
①称取拟南芥种子0.015g左右,种子称量的准确性将很大程度影响含油量。
②先在5ml氯仿预洗过的玻璃管中加300μL C17 ,氮气吹干。
③加入种子,甲苯混匀,加入0.2%甲醇溶液(BHT),最后加5%(v/v)硫酸甲醇。
④将上述溶液混合振荡30秒,置于90℃~95℃水浴中1.5小时。
⑤冷却置室温,加入1.5ml0.9%(w/v)NaCl。
⑥2ml正己烷色谱纯(Hexane)萃取。
⑦重复步骤6再两次。
⑧收集萃取液,氮气吹干,加正己烷色谱纯至60μL。
⑨用微型进液器进1μL样品于气相色谱仪进行测定。


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